一昨年、昨年と日本睡眠学会学術集会で研究発表を行い、参加者からひときわ高い関心を集めた渡辺オイスター研究所のもとに昨秋、ある依頼が舞い込む。第３９回日本睡眠学会学術総会で「ベストプレゼンテーション賞」が授与され、多くの研究者、医学者からその名声が鳴り響くことになった同社・渡辺　貢代表（医学博士、畜産学博士）に思いもかけない投稿依頼をしてきたのは、誰あろう分子免疫学の第一人者・本庶　佑博士本人だったというから驚く。毎年ノーベル賞候補に挙げられるほどの著名な博士だが、京大医学部医化学の教授職の傍ら、生命医化学の学術誌サイエンス・ダイジェスト（ＭＳＤ）の編集主幹を長年務めてきたことでも知られる。その学術誌への研究論文発表を本庶博士直々に渡辺代表宛て依頼してきたわけだ。そして１０月号（２０１５年４１巻・通巻５４２号）に掲載された。掲載論文は「マガキ軟体部エキスから同定された新規抗酸化物質3,5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol:脳移行性とヒトの睡眠に与える影響」である。本稿ではダイジェスト版として掲載したい。


概説 マガキ軟体部エキスから低分子かつ両新媒性の新規抗酸化物質3,5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol（ＤＨＭＢＡ）を同定し、ラット血液脳関門（ＢＢＢ）再構成モデルを用いたin vitro試験と、マウスへの経口投与後のＬＣ-ＭＳ/ＭＳを用いた測定試験により、本物質の脳内移行性を確認した。次いでマガキ軟体部エキス由来の本物質含有分画をヒトに投与し脳波測定により有意な中途覚醒抑制作用を認めた。 はじめに 本試験では、ＤＨＭＢＡの脳内移行性をラットＢＢＢキットを用いたin vitro試験により検討し、さらにＤＨＭＢＡ含有分画のヒトの睡眠に対する影響を検討した。

方法 １）ラット型ＢＢＢキットを使用し、Tight junction細胞間隙輸送能の標準物質としてのFluorescein-Naと試験対象物ＤＨＭＢＡの透過係数を算出した。 ２-１）C57BL/6NCrSlc雄性マウス（９週齢、平均体重２１±１ｇ）を用い、摂食（固形飼料ＣＲＦ-１）と飲水は自由摂取として７日間の予備飼育を行い馴化した後、ＤＨＭＢＡの投与前に１６時間の絶食を行った。動物実験は、筑波大学実験動物委員会の審査を受け、その承認を得た後に実施した。 ２-２）ＤＨＭＢＡを純水に溶解（３０㎎/ｍｌ）し、マウス用経口ゾンデを用いて体重２０ｇ当たり０．２ｍｌを経口投与した。血漿を採取後１０％trichloroacetic acid（ＴＣＡ）による除タンパクを行い、遠心分離後の上清を－８０℃にて凍結保存した。採血後、直ちに断頭して脳を摘出し３倍量のPhosphate Buffered Salineを加えてポリトロンにてホモジネートを調整した。次いで熱処理（１００℃、５min）と、１０％ＴＣＡによる除タンパクを行い、遠心分離後の上清を－８０℃にて凍結保存した。 ３）血漿と脳中のＤＨＭＢＡ濃度は、液体クロマトグラム／タンデム質量分析装置を用いて定量した。定性分析には、Ｑ１スキャン、プロダクトイオンスキャンを用いた。定量分析にはエレクトロスプレーイオン化法を用い、多量反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いた。 ４）対象者はアテネ式不眠尺度（ＡＩＳ）が６点以上で、週に複数回の中途覚醒を自覚する勤労者男女２８名（４４．０±７．２歳）を選択し、被験飲料（ＤＨＭＢＡ含有量０．３７㎎）とプラセボ飲料を一日１本（５０ｍｌ）二重盲検プラセボ対照比較試験にて４週間連続摂取した。その間、ＡＩＳによる主観的評価と携帯型脳波計を用いた睡眠時脳波による客観的評価にて被験飲料の睡眠に与える影響を検討した（なおＡＩＳの評価方法として、事前検査時のＰＯＭＳ-短縮版の抑うつが解析対象者の中央値５９点未満１３名を対象に解析。脳波の解析可能なデータが２日間未満の計８名は解析から除外されている）本試験は、(医)健昌会倫理審査委員会の審査を受けその承認を得た後に実施した。 結果および考察 ＢＢＢキットによるＤＨＭＢＡの透過係数測定では、ＤＨＭＢＡの全平均Ｐａｐｐ値は４．１±０．７×１０-6㎝/sであり、Fluorescein-Naと同レベルの脳内移行性を持つことが明らかになった。 また、ＤＨＭＢＡの定量分析においては、ＤＨＭＢＡ標準品の濃度範囲１～１０００ng/ｍｌにおける検量線の相関係数Ｒは０．９９９８であり、１ng/ｍｌでの面積値再現性は相対標準値差が９．６８％であり、良好な再現性が得られた。 血漿中半減期と脳移行性においては、経口投与１０分後の脳の１０００倍希釈試料のＭＲＭクロマトグラムから保持時間４．４～４．６分の範囲にＤＨＭＢＡの単一のピークが検出され、脳中濃度は９２．６μｇ/ｇ　wet weightであった。さらに、投与１０分後の血漿と脳からＤＨＭＢＡが検出され、in vitroにおけるＤＨＭＢＡの消化管吸収性と脳移行性も確認された。 こうした結果から求めたＤＨＭＢＡの血漿中半減期は１２．４分、脳中半減期は２８．９分であり、ＤＨＭＢＡの脳中半減期は血漿中半減期に比べて２倍以上長いことが明らかになった。 一方、被験飲料のヒト睡眠に与える影響についても、ＤＨＭＢＡが有用な改善作用をもたらすことが示された。被験飲料群のＡＩＳは摂取前の１０．６±２．９から４週目の４．９±２．０へ群内で有意に低く、また４週目の被験飲料群の得点４．９±２．０はプラセボ群の８．８±４．４より群間でも有意に低かった。これにより被験飲料群のＡＩＳは６点以下になり有意な睡眠改善作用が認められる。 脳波測定による客観的な睡眠評価でも被験飲料群では中途覚醒の増加が抑制されたことを示している。 中途覚醒時間の割合を解析した結果、プラセボ群で摂取開始時６．０±２．０％から４週目で８．５±４．３％と有意に増加したが、被験診療群では摂取開始時から４週目まで有意な変化は生じなかった。４週目の群間比較でもプラセボ群の覚醒時間の割合（８．５％）は、被験飲料群（５．２％）より有意に高値を示している。 結語 １）ＢＢＢキットを用いたin vitro試験によりＤＨＭＢＡの脳内移行性を確認した。 ２）ＤＨＭＢＡ投与前の血漿と脳にはＤＨＭＢＡは検出されず、ＤＨＭＢＡはマウス生体内に存在しないことが示された。 ３）ＤＨＭＢＡの経口投与１０分後の血漿と脳からＤＨＭＢＡが検出され、ＤＨＭＢＡの消化管吸収性と脳内移行性が確認された。 ４）ＤＨＭＢＡの血漿中半減期は１２．４分であり、脳中半減期は２８．９分であった。 ５）マガキ軟体部エキスのＤＨＭＢＡ含有分画を主成分とする被験飲料による有意な中途覚醒抑制作用が睡眠時脳波測定により検知され、有意な睡眠改善作用がＡＩＳによって示された。

渡辺　貢（１）福嶋　和代（１）三木　恵美子（１） 有竹　浩介（２）裏出　良博（２） （１）株式会社　渡辺オイスター研究所　（２）筑波大学　国際統合睡眠医科学研究機構（ＷＰＩ-ＩＩＩＳ）